Дубравы из пробирки

Деградация дубрав стала глобальным явлением, она отмечается практически во всех ареалах многих видов дуба на планете по целому ряду причин: это и усыхание деревьев, и нерегулярность их плодоношения, и длинный репродуктивный цикл породы. Кроме того, желуди имеют непродолжительный срок хранения, сильно поражаются вредителями и болезнями, а также поедаются мелкими и крупными лесными животными.

Проблема размножения

Состояние дубовых лесов как в России, так и во всем мире вызывает все большую тревогу. Эта проблема не обошла стороной даже особо охраняемые территории, в том числе Кавказский государственный природный биосферный заповедник, объявленный ЮНЕСКО всемирным природным наследием. Заповедник попал в зону строительства олим-пийских объектов, в результате чего над многими произрастающими здесь редкими видами нависла угроза уничтожения. Метод клонального микроразмножения поможет остановить деградацию дубрав и редких представителей флоры.

В природе есть два способа размножения растений: половой (семенной) и вегетативный. Оба имеют свои преимущества и недостатки. Так, при семенном размножении растения обладают высокой генетической разнородностью, поскольку содержат признаки обоих родителей. Например, при семенном размножении карельской березы только небольшая часть сеянцев обнаруживает свойства карелистости (к 8–10-му году роста) – характерные вздутия ствола, придающие высокую декоративность древесине.

При вегетативном размножении растений материнский генотип сохраняется, однако для многих видов, в особенности для древесных пород, данный способ не подходит. С возрастом дерева снижается его регенерационная способность, кроме того, размножение прививками затратно, трудоемко, часто случается отторжение привоя.

Одним из наиболее радикальных способов сохранения выдающихся и уникальных генотипов лесных древесных растений, и в частности различных видов дуба, является принципиально новый способ вегетативного размножения – клональное микроразмножение – это совокупность методов, позволяющих вырастить целые растения, генетически идентичные исходному, в условиях in vitro (в стерильной пробирочной культуре) из фрагментов их органов или тканей.

Микроразмножение – это совокупность методов, позво-ляющих вырастить целые растения, генетически идентичные исходным, в условиях in vitro (в стерильной пробирочной культуре) из фрагментов их органов или тканей.

Следуя путем in vitro

Процесс основан на явлении тотипотентности – свойстве соматических (не половых) клеток растений полностью реализовывать наследственную программу онтогенетического развития и при определенных условиях выращивания (in vitro, на соответствующей питательной среде, в присутствии гормонов, в контролируемых условиях культивирования) развиваться до взрослого растения. Любая отделенная часть растений при создании благоприятных условий может индуцировать адвентивные (дополнительные) почки, из которых развивается целое растение, принятое называть регенерантом.

Метод клонального микроразмножения имеет ряд преимуществ перед традиционными способами размножения. Прежде всего, это:

• получение генетически однородного посадочного материала, свободного от вирусов;
• высокий коэффициент размножения; ускоренные развитие и рост и переход к репродуктивной фазе;
• размножение растений, трудно размножаемых традиционными методами;
• возможность размножения растений, которые в естественных условиях репродуцируются с большим трудом;
• проведение работ по размножению посадочного материала независимо от климатических и погодных условий в течение года и некоторые другие.

В 50-х годах XX века Жан Морель первым получил растения-регенеранты орхидеи. Затем в культуру in vitro были введены растения гвоздики, хризантемы, гороха, кукурузы и другие травянистые культуры. В нашей стране работы в этом направлении проводились в Институте физиологии растений, в лаборатории Раисы Георгиевны Бутенко. Число растений, размножаемых микроклональными способами, со временем многократно возросло и включило древесные породы.

Работы по культуре ткани древесных растений впервые были начаты в середине 20-х годов прошлого века во Франции. Роже Готре работал с несколькими видами вяза и сосны. В середине 1960-х годов Матес получил первые регенеранты осины, которые были доведены до почвенных культур.

Однако культивирование тканей древесных растений имеет ряд трудностей. Древесные культуры отличаются медленным ростом, плохой укореняемостью, содержанием фенольных соединений, приводящих к ингибированию роста эксплантов. Кроме того, с возрастом дерева-донора регенерация тканей значительно замедляется, в них происходит накопление внутренней инфекции. Но несмотря на перечисленные трудности, к настоящему времени насчитывается более 200 видов древесных растений из 40 семейств, которые были размножены in vitro (каштан, дуб, береза, клен, осина, секвойя, гибриды тополей и осины, некоторые хвойные и др.).

Сотворение регенеранта

Процесс микроклонального размножения состоит из нескольких эта-пов:

1) выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры;

2) собственно размножение – массовое получение посадочного материала и его укоренение;

3) адаптация к условиям тепличного грунта и перевод в полевые условия, подготовка к реализации.

На первом этапе необходимо добиться получения стерильной, хорошо растущей культуры, что зависит от выбора донорских тканей: стебля, корня, почек, листьев и др. – и от способа проведения поверхностной стерилизации. Иногда для получения стерильной культуры приходится добавлять стадию обработки антибиотиком, который может быть введен и в питательную среду на протяжении нескольких пересадок.

На втором этапе отрабатывают оптимальные условия индукции адвентивных почек и развития их в побеги, что обеспечивает получение необходимого количества посадочного материала.

При этом надо отметить, что в культуре клеток и тканей может наблюдаться явление сомаклональной изменчивости, т. е. возникновение мутаций, приводящих к формированию как нежизнеспособных форм, так и форм с новыми полезными свойствами (например, декоративные карликовые растения), что повышает генетическое разнообразие исходного материала и дает селекционеру возможность отбора новых форм с полезными свойствами.

Третий этап – укоренение. На этой стадии происходит смена гормо-нального состава питательных сред, причем одни растения образуют корни спонтанно, без гормонов (карельская береза, петунии и др.), а для других требуется сложная гормональная система, состоящая из 2–3 различных укоренителей.

Растения-регенеранты в пробирках отличаются от обычных растений целым рядом параметров. Во-первых, они находятся в условиях 100 %-ной влажности, при которых нет необходимости функционирования устьичного аппарата. Во-вторых, изменено клеточное дыхание. Поэтому на третьем этапе возникает множество проблем, для разрешения которых необходима медленная адаптация микроклонально размноженных растений к условиям in vivo: посадка в грунт под пленочные покрытия, повышенная влажность (туманные установки), подбор температурных условий (закаливание) до образования первых нормальных листьев с хорошо развитым устьичным аппаратом.

Растения-регенеранты сохраняют в виде растущих коллекций в условиях in vitro. Все работы по клональному микроразмножению проводят в лаборатории, в закрытых боксах, где обеспечивается асептика путем подачи стерильного воздуха.

В культуре клеток и тканей может наблюдаться возникновение мутаций, приводящих к образованию как нежизнеспособных форм, так и форм с новыми полезными свойствами.

Преодолевая трудности

При микроразмножении дуба, в отличие от других древесных видов, возникает много сложностей. Об этом упоминается в многочисленных статьях отечественных и зарубежных авторов. Так, например, указывается, что у развивающихся почек в условиях in vitro происходит отмирание верхушки почки (апикальное усыхание); экспланты необходимо постоянно снабжать ростовыми гормонами, направляющими их развитие в ту или иную сторону, и часто пересаживать на свежую питательную среду.

До настоящего времени исследования по микроклональному размно-жению дуба черешчатого проводились в основном на ювенильном материале (проростках желудей). Деревья дуба значительно различаются по внешним фенотипическим признакам: высоте, форме ствола, ветвистости, урожайности. Селекция ведется на выявление плюсовых деревьев, обладающих этими признаками в большей степени.

В силу ветроопыляемости дуба в естественных условиях определить, какое дерево является опылителем (отцом), практически невозможно, поэтому семенное потомство плюсовых деревьев может не проявлять признаков плюсовости. В связи с этим для сохранения материнского генотипа наиболее перспективным подходом является микроклональное размножение (почками, побегами) взрослых плюсовых деревьев. При этом растения-регенеранты будут обладать всеми признаками материнских деревьев.

Необходимо поэтапное освоение методики. Для подбора способов стерилизации, минерального и гормонального состава питательных сред целесообразно начинать с размножения ювенильного материала. После чего можно приступать ко второму этапу – разработке методики для размножения взрослых деревьев.

Сотрудникам лаборатории лесной генетики НИИЛГиС удалось пре-одолеть ряд трудностей, связанных с культивированием дуба in vitro, и найти пути решения проблемы размножения и сохранения различных видов дуба с помощью биотехнологических способов.

Термин «клон» был предложен в 1903 году Уэбстером (от греч. klon – «ветвь, отпрыск»).

Большие возможности

Размноженный in vitro ценный генетический материал дуба может быть использован для закладки архивов клонов и испытательных культур на различных территориях, в том числе и природоохраняемых (Краснодарский и Ставропольский край). Используя биотехнологические приемы, можно вырастить необходимое количество растений д. колонновидного, являющегося хорошим подвоем для прививок по причине слабой отторгаемости последних. Особое место должно занимать размножение д. ножкоцветного, который в настоящее время остался в виде отдельно растущих деревьев в Кавказском заповеднике.

Микроклональное размножение древесных растений имеет большое значение для практического лесоводства, поскольку биотехнологические подходы дают возможность получения заданного количества посадочного материала с улучшенными наследственными свойствами независимо от пе-риодичности плодоношения деревьев, что способствует повышению качественного состава лесонасаждений и обеспечивает значительный экономический эффект. Появляется возможность размножения отдельных деревьев, имеющих ценный и уникальный генотип, а также сохранения исчезающих видов и, следовательно, биоразнообразия.

В настоящее время микроклональное размножение интенсивно используется в производстве посадочного материала березы, тополя, ели черной, сосны ладанной и с. скрученной практически во многих развитых странах, где имеются технологии, применяющиеся в промышленных масштабах, и созданы многочисленные лесоводческие фирмы (в ФРГ, Финляндии, Франции, Канаде, Австралии, Новой Зеландии и др.). К сожалению, в лесном хозяйстве России эта биотехнология пока не заняла достойного места, хотя отечественные разработки по применению методов клеточной инженерии в селекции древесных пород стоят на передовых позициях

В нашей стране исследования в данном направлении проводятся (или ранее проводились) в ФГУП НИИЛГиС (г. Воронеж); ФГУ СПбНИИЛХ; ИЛ СО РАН (г. Красноярск); ИБХ РАН (г. Пущино Моск. обл.); ВНИАЛМИ (г. Волгоград); ботаническом саду–институте УНЦ РАН (Уфа); Институте леса Кар НЦ РАН (Петрозаводск); Марийском государственном техническом университете (Йошкар-Ола) на различных лесных древесных растениях (дуб, сосна, ель, лиственница, береза и др.).